背景：

FabCOUPER protease是一种丝氨酸蛋白酶，重组表达于E.coli，C端带6×His标签。可在铰链上方的单个位点特异性消化人IgG1，无需还原条件即可在两小时内产生完整的Fab和Fc片段。

包装规格：

Rhinogen^® FabCOUPER protease包装规格如下：

产品储存于50 mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA，pH7.6, 不添加防腐剂。

产品来源：

Rhinogen^® FabCOUPER protease重组表达于E. coli，理论分子量约71.82KD。

产品特性：

Rhinogen^® FabCOUPER protease是一种蛋白酶，可在铰链上方的单个位点特异性消化人IgG1，无需还原条件即可在两小时内产生完整的Fab和Fc片段。该酶对具有突变铰链区的抗体（例如LALA突变）具有活性。

酶活定义：

在50mMTris-HCl，150mM NaCl，10mM CaCl₂，pH7.6条件下，37℃孵育2小时，1单位酶（1U）可消化1µg人IgG1的≥90%，通过SDS-PAGE确认。

储存条件：

1. 冷藏运输，到达时应储存在-70℃- -20℃条件下；

2. 由于FabCOUPER protease具有自降解活性，解冻后应保持低温并尽量在的同一天使用。同时可适当分装后冻存，避免多次冻融。

应用：

突变抗体和Fc融合蛋白消化及结构分析。

使用建议：

实验准备：

1. 配制消化缓冲液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.6；

2. 使用前，请将Rhinogen^® FabCOUPER protease从-20℃取出解冻，瞬离备用；

3. 将20×CaCl₂从-20℃取出解冻，瞬离备用。

操作说明：

1. 使用消化缓冲液将人IgG1调整至0.5-5.0mg/ml；

2. 按1U FabCOUPER protease/1μg人IgG1的比例进行消化，确保最终反应体系中含有10mM CaCl₂；

3. 以消化100μg人IgG1（2mg/ml）为例，将50μl人IgG1加入到EP管中，加入5μl FabCOUPER protease（20U/μl），加入5μl 20×CaCl₂，加入40μl 消化缓冲液补足至100μl；

4. 轻柔混匀后瞬离，37℃条件下反应2小时。

注意：

1）根据底物的不同，可能需要优化酶的用量和消化时间；

2）反应可以线性放大或缩小；

3）酶液可以适当稀释。

Q1：是否可以调整消化温度？

A1：FabCOUPER protease的最适温度37℃，在22-30℃也显示出活性，在4℃或55℃检测不到明显活性。

Q2：该怎么选择消化缓冲液？

A2：在pH值为7.0-8.5的TBS缓冲液中可获得最佳活性。其它类型的缓冲液可能需要实验验证。应避免含有磷酸盐的缓冲液，因为磷酸盐离子会与酶活性所需的钙离子一起形成不溶性磷酸钙盐。

Q3：酶的自降解是否会影响抗体消化？

A3：FabCOUPER protease长时间孵育可导致蛋白酶完全降解，但自降解后的酶保持酶活性，延长孵育时间并不会产生非特异性水解。