背景：

科学研究表明，人体中存在的蛋白质超过50%是以糖蛋白的形式存在。蛋白质糖基化作为生物体内最重要的蛋白质翻译后修饰形式之一，具有重要的生物学功能，不仅影响蛋白质的空间构象、生物活性、运输及定位等，而且还参与分子识别、细胞通信、细胞分化、信号转导、免疫应答等等在内的各种重要生命活动。在多种疾病，如肿瘤（FDA已批准的用于癌症疾病诊断和监控的生物标志物中大部分是糖蛋白）、神经退行性疾病、心血管病、代谢性疾病、免疫性疾病及感染性疾病的发生发展中均伴随着蛋白质糖基化程度及糖链结构异常的发生。此外，糖基化还显著影响生物治疗剂的生物活性、靶标、运输、血清半衰期、清除率及受体识别等性质。例如，重组促红细胞生成素的药代动力学和效力受其糖基化状态的严重影响，而单克隆抗体通过ADCC介导功效的能力受Fc区岩藻糖含量的影响，因此蛋白质糖基化研究是继核酸、蛋白质之后生命科学中又一极具潜力的研究领域，具有重要理论及应用意义。FDA要求所有类型的糖蛋白都需要进行糖型分析。

肽N-糖苷酶F（PNGase F，EC 3.5.1.52）是从糖蛋白中特异性除去N-连聚糖的糖苷内切酶，是一类重要的糖基化研究的工具酶，被广泛用于治疗性蛋白质上N-连糖链位点、结构信息及功能关系的研究。Rhinogen^® PNGase F (Glycerol-free)是表达于大肠杆菌 BL21中的重组PNGase F，能够将绝大多数N-糖链（除含α-1,3连接的核心岩藻糖，常见于植物及昆虫糖蛋白）完整地从其所连接的蛋白分子上释放下来，可以在 N-连糖肽或糖蛋白的高甘露糖、杂合和复杂寡糖部分最内侧的 N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨残基（Asn）之间进行切割，释放出完整的寡糖链，如图1A。在释放糖链的同时将氨基酸特征序列上的天冬酰胺残基转化为天冬氨酸残基，其赋予蛋白质+ 1Da质量变化，如图1B。它对多种底物具有高度活性，包括纯化的糖蛋白和人血清糖蛋白的复合混合物。此外，由于不含甘油，在非变性条件下，酶与HPLC及质谱工作流程环境兼容。连接到N-连寡糖的磷酸盐，硫酸盐和唾液酸基团不影响N-糖链的释放。

图1A. PNGase F切割位点

图1B. PNGase F释放糖链的反应机制^[15]

产品包装：

Rhinogen^® Immobilized PNGase F，Microspin包装规格如下：

一支Immobilized PNGase F，Microspin可用于0.2mg糖蛋白的N-聚糖去除。

产品特性：

固定化 PNGase F 是一种树脂，其中 PNGase F（肽 N-糖苷酶 F）酶与琼脂糖珠共价偶联，用于去除抗体、融合蛋白和其他 N-糖基化蛋白上的 N-聚糖。该酶重组表达自大肠杆菌中，序列来源于Flavobacterium meningsepticum。每支Immobilized PNGase F，Microspin柱含有足够的材料来去除 0.2mg 糖蛋白中的 N-聚糖。

酶活定义：

在37℃，pH8.6的TBS中反应1h， 0.05 ml Immobilized PNGase F能从0.2 mg依那西普中水解≥95%的N -聚糖，通过SDS-PAGE检测。

储存体系：

产品储存于20%乙醇中，不添加防腐剂。

配套试剂：

保藏条件：

采用冰袋运输，收到产品后请立即将酶置于4℃，严禁冻存；配套试剂置于-20℃储存。本品不含防腐剂，务必确保无菌操作取用，避免污染。

特性：

Rhinogen^® Immobilized PNGase F，Microspin适用于蛋白质组学及糖生物学研究中糖蛋白上N-连寡糖链的有效释放，具有如下特性：
1. 高稳定性：每批产品都经过严格的质量控制，以实现产品批间稳定性；
2. 高比活性：有效和完全的释放N-连聚糖；
3. 与下游HPLC、质谱兼容：不含甘油，酶切体系与HPLC及质谱工作流程环境兼容。

应用：

1. 从糖肽及糖蛋白上释放完整的N-连聚糖；

2. 表征蛋白质是否糖基化；

3. 用于分子量检测或晶体学研究时去糖基化蛋白质的制备；

4. N-糖基化糖蛋白的结构-功能研究；

5. 糖基化位点的确定。

Q1：PNGase F去糖基化后得到什么产物？

A1：利用Rhinogen® Immobilized PNGase F，Microspin进行糖蛋白去糖基化后， 会释放出完整的寡糖链，并在释放糖链的同时将氨基酸特征序列上的天冬 酰胺残基转化为天冬氨酸残基。

Q2：为什么蛋白被降解了？是否可以在PNGase F去糖基化反应体系中加入蛋白酶抑制剂？

A2：蛋白酶会干扰去糖基化实验的结果，当蛋白质处于变性状态时，它更容易 被蛋白酶切割。下列蛋白酶抑制剂中的任何一种均可用于 Rhinogen®Immobilized PNGase F，Microspin 去糖基化反应体系中： 抑肽酶 （终浓度10μg/ml） 苄脒（终浓度1mM） 胃蛋白酶抑制剂（终浓度10μg/ml） 亮肽素（终浓度1μM） EGTA（终浓度1mM） EDTA（终浓度1mM） 各种蛋白酶抑制剂建议配制成1000×的浓缩母液，胃蛋白酶抑制剂溶解在甲 醇溶液中，其余抑制剂均溶解在水中。

Q3：PNGase F 在含有尿素的反应体系中是否可以正常使用?

A3：有文献报道，PNGase F在37℃条件下，在2.5M尿素溶液中可以稳定24hr， 在5M尿素溶液中可以保留40％的活性[16]。因此反应体系中存在较低浓度 的尿素可能不影响Rhinogen® Immobilized PNGase F，Microspin去糖基化的 活性。

Q4：对于天然糖蛋白，我应该去除糖蛋白上的寡糖链？

A4：当糖蛋白不用SDS变性时，由于空间位阻效应（二级和三级蛋白质结构）， Rhinogen®Immobilized PNGase F，Microspin 相对很难到达寡糖链的切割位 点。在酶用量固定的基础上，更长的反应时间有助于提高酶去除寡糖链的 效率，但每种糖蛋白都有其特异性，必须根据实验或者经验确定。

Q5：表面活性剂是否会抑制外切糖苷酶/糖苷内切酶活性?

A5：离子及非离子型表面活性剂在0.5-1.0%浓度范围时，大多数糖苷酶都不受 或受到较小影响。但PNGase F、O-Glycosidase及β1-4 Galactosidase这 3种 酶会受SDS的抑制，必须加入1%终浓度的NP-40到反应混合物中才能解 除抑制。