背景：

目前越来越多的抗体和抗体融合蛋白被用作生物治疗剂，这些生物治疗剂的性质又显著受其糖基化状态的影响。例如，重组促红细胞生成素的药代动力学和效力受其糖基化状态的严重影响， IgG的Fc区Asn297处的保守N-连聚糖对其功能活性至关重要。此外，一些抗体还具有额外的N-连聚糖，如图A，其与Fc区Asn297处的保守N-聚糖一起影响抗体的识别、半衰期和免疫应答反应。然而在细胞培养过程中的各种变量都可能会导致抗体糖基化程度的改变及增加其聚糖多样性，因此在生产过程中监测抗体的糖基化状态对于获得正确的糖蛋白形式至关重要。

Rhinogen^® 提供的Quick™ PNGase F-Plus 是一种改进的重组试剂，具有快速高效及保留完整的去糖基化蛋白（非还原条件下）的特性，适用于治疗性单克隆抗体的开发和质量控制过程中N-连糖链的分析及蛋白质组学分析。快速处理时间降低了通过标准PNGase F长时间酶促去糖基化反应方案可能引入的杂质和不需要的蛋白质修饰（氧化，脱酰胺）的风险。

产品包装：

Rhinogen^® Quick™ PNGase F-Plus包装规格如下：

产品来源: 

Rhinogen^® Quick™ PNGase F-Plus是由大肠杆菌表达得到的重组糖苷酶，分子量大小为36kDa。

产品质量：

通过SDS-PAGE分析，纯度≥95%；没有检测到污染的外切糖苷酶、糖苷内切酶及蛋白酶活性。

产品特性：       

热失活条件：75℃处理10min。

产品特点：

高 效：快速、无偏好释放N-连聚糖；
高 纯 度：没有污染蛋白酶/糖苷酶，纯度≥95％；
高适用性：对多种结构抗体或糖蛋白有效；
高稳定性：每批Quick™ PNGase F-Plus 产品都经过严格的质量控制，以实现高稳定性；
保留完整二硫键：保留完整的去糖基化蛋白使得蛋白质表征更方便，减少偏差（非还原条件下）。

保藏条件：

采用冰袋运输，收到产品后请立即将酶置于2-8℃条件下储存，严禁冻存；配套试剂置于-20℃储存，其中Quick™ 反应增强剂冻干粉溶解后，-70℃可储存一个月，2~8℃可储存一周；酶液中不含防腐剂，务必确保无菌操作取用，避免污染。

应用：

1. 在数分钟内快速完成抗体或抗体融合蛋白的完全快速去糖基化；

2. 抗体及抗体-融合蛋白生产过程中糖基化状态监测；

3. 抗体及抗体-融合蛋白生物治疗剂的产品质量控制；

4. 蛋白质组学应用及研究。

操作说明：

本产品仅供研究使用，不适用于人或动物的诊断及治疗用途。

Q1：Rhinogen® QuickTM PNGase F-Plus 去糖基化后得到什么产物？

A1：利用Rhinogen®QuickTMPNGaseF-Plus进行抗体及抗体融合蛋白去糖基化后， 会快速完全地释放出所有N-连寡糖链，并在释放糖链的同时将氨基酸特征序 列上的天冬酰胺残基转化为天冬氨酸残基。

Q2：还原和非还原条件下的操作方法有什么区别？

A2：还原条件下，能在数分钟内使抗体和相关的融合蛋白快速完全去糖基化，是 治疗性单克隆抗体的开发和质量控制过程中下游N-聚糖分析和应用的理想 选择。非还原条件下，能保持抗体二硫键的完整性，获得完整去糖基化多聚 体蛋白（即抗体），是质谱研究去糖基化蛋白时的理想选择。

Q3：Rhinogen® QuickTM PNGase F-Plus 理想的对照底物是什么?

A3：抗MBP单克隆抗体是QuickTMPNGaseF-Plus的良好对照底物

Q4：如何检测Rhinogen® QuickTM PNGase F-Plus在10分钟内是否完全去糖基 化？

A4：对于单克隆抗体，在去除N-聚糖之后在SDS-PAGE上可以观察到糖基化抗 体与去糖基化抗体在凝胶上位置的变化。如果需要更精确的检测是否残留少 量的糖基化抗体，可以采用更敏感的测定（例如，LS-ESI-TOF）。

Q5：下游HPLC及MS分析是否与Rhinogen® QuickTM PNGase F-Plus 兼容？

A5：是的，制备液相色谱和/或质谱的样品，可以通过常规的固相萃取方法如C18 和石墨化碳分离N-聚糖；去糖基化蛋白通过微量透析或微过滤交换缓冲液后 用于质谱分析，当然您也可以在酸性条件下将QuickTM反应增强剂分解成无 干扰的副产物，不会抑制肽电离。

Q6：蛋白酶抑制剂混合物可以用于 Rhinogen® QuickTM PNGase F-Plus 反应吗？

A6：可以，如下蛋白酶抑制剂混合物与QuickTMPNGaseF-Plus反应相容。 抑肽酶（10μg/ml终浓度）；苄脒（1mM终浓度）；抑胃酶抑制素（10μg/ml 终浓度）；亮抑酶肽（1μM终浓度）；EGTA（1mM终浓度）；EDTA（1mM 终浓度）。

Q7：Rhinogen® QuickTM PNGase F-Plus 反应与胰蛋白酶是否兼容？

A7：是兼容的，可以将胰蛋白酶直接加入用QuickTMPNGaseF-Plus消化的样品中。