背景：

Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)包含O-Glycosidase及α2-3,6,8,9 Neuraminidase，二者均是重要的糖基化研究的工具酶，组合用于糖蛋白O-连糖链的酶切释放。Rhinogen^® O-Glycosidase能够将糖蛋白中Ser或Thr残基的羟基连接的Core 1（Gal-β(1-3)-GalNAc-）及Core 3（GlcNAc-β(1-3)-GalNAc-）O-连双糖释放下来，如图1。核心结构的任何修饰都可以阻断O-Glycosidase的作用，最常见的修饰是核心结构的单、二或三唾液酸化。Rhinogen^® α2-3,6,8,9 Neuraminidase能够释放O-连糖链非还原末端α (2,3)-, α (2,6)-, α (2,8)-, α (2,9)-唾液酸残基，如图2，不同唾液酸残基的释放速率大致为α (2,6)-＞α (2,3)- ＞α (2,8)- ＞α (2,9)-。唾液酸酶的这种组合模式使得O-连糖链的酶切释放更彻底。该Kit包含的所有酶及试剂均与下游HPLC及MS兼容。

 图1. O-Glycosidase与α2-3,6,8,9 Neuraminidase组合用于糖蛋白O-连糖链的酶切释放

图2. Rhinogen^® α2-3,6,8,9 Neuraminidase作用位点

包装规格：

Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)包装规格如下：

配套试剂：

Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)提供的配套试剂如下：

产品来源：

本试剂盒中的所有酶都是大肠杆菌BL21中表达并分离纯化的重组酶：O-Glycosidase分子量为147kDa；α2-3,6,8,9 Neuraminidase分子量为66KDa。

产品质量：

SDS-PAGE分析，纯度≥95%；没有检测到污染的糖苷外切酶、糖苷内切酶及蛋白酶活性。

酶活定义：

1个O-Glycosidase酶活力单位定义：在100μl反应体系中，37°C，pH7.5条件下，1小时内从5mg唾液酸酶消化后的非变性fetuin 上催化释放0.68nmol O-连二糖所需要的酶量。1U Rhinogen^® O-Glycosidase =1 unit NEB O-Glycosidase。

1个α2-3,6,8,9 Neuraminidase酶活力单位定义：在37°C，pH5.5条件下，以对硝基苯基-α-D-N-乙酰神经氨酸为底物，1分钟内催化释放1 μmol 对硝基苯酚所需要的酶量。1U Rhinogen^® α2-3,6,8,9 Neuraminidase =1 U Prozyme Glyko^® Sialidase ATM。

储存条件： 

-20°C。

产品特点：

Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)具有稳定性高、比活性高等特点，是两种高度纯化和非常稳定的糖苷酶的组合，适用于蛋白质组学及糖生物学研究中糖蛋白上常见O-连聚糖的有效释放。

1. 高纯度：没有污染蛋白酶/其它糖苷酶，纯度≥95％；

2. 高稳定性：每批Kit试剂盒中酶及试剂都经过严格的质量控制，以实现高稳定性；

3. 高比活性：有效释放糖蛋白上唾液酸修饰O-连聚糖；

4. HPLC、MS兼容：试剂盒中所有的酶及试剂与下游HPLC及MS兼容。

应用：

1. 聚糖结构分析;

2. 结合位点及功能分析;

3. 治疗性糖蛋白的表征及质量控制;

4. 蛋白质组学分析，消除糖蛋白的异质性。

使用建议：

变性条件下去糖基化方案：

1. 取10-100µg糖蛋白溶液，加入1µl 10×Denaturing缓冲液，补加纯化水使得反应体系为10µl；

2. 将上述10µl体系100℃处理10min，使糖蛋白完全变性；

3. 室温冷却5min；

4. 在上述变性体系中，分别加入2µl 10×Glyco缓冲液2、2µl 10% NP-40溶液、1-4μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，补加纯化水至反应总体积为50μl，轻柔混匀；

5. 37°C 条件下反应1-5hr；

注意：对于不同的糖蛋白样品，需要实验摸索最适的酶浓度及反应时间。

非变性条件下去糖基化方案：

1. 取10-100µg糖蛋白底物溶液，加入2µl 10×Glyco缓冲液2、纯化水及1-4μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，使得总反应体积为20µl，轻柔混匀；

2. 37°C 条件下反应1-4hr。

注意：通常情况下，糖蛋白变性与否不显著影响O-连糖链去除的效率，但也不排除个例，建议根据自己的底物特性，选择合适的方法。

当对天然糖蛋白去糖基化时，建议将等量糖蛋白样品进行变性后再同步进行酶切作为阳性对照，以确定非变性条件下去糖基化反应的程度。

操作说明：

1. 上述操作方法旨在为Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)作为去糖基化试剂操作的一般指南，对于不同的糖蛋白样品，去糖基化活性高度依赖于反应条件，建议进行适当优化或根据经验确定最优的操作方法；

2. 去糖基化体系可以线性放大或缩小；

3. 由于变性缓冲液中含有SDS，而SDS会抑制Rhinogen^® O-Glycosidase的活性，因此在变性糖蛋白反应体系中需加入终浓度为1%的NP-40，其能有效解除SDS对O-Glycosidase酶活的抑制；

4. 本产品适用于天然或者变性糖蛋白，对于天然糖蛋白的去糖基化，可能需要更多的酶及更长的反应时间；

5. EDTA、对氯丙基苯磺酸、Mn2+、Zn²⁺对O-Glycosidase的酶活有一定的抑制作用，1mM各物质存在条件下，酶活回收率分别为63%、60%、44%、66%；

6. 本产品仅供研究使用，不适用于人或动的物诊断及治疗用途。

Q1：此试剂盒与下游HPLC及MS兼容吗？

A1：是的，Rhinogen^® Protein Deglycosylation Kit Ⅰ (for O-linked Glycans )所有的酶及缓冲试剂均与下游HPLC及MS应用兼容。可以采用微透析或微量过滤制备HPLC及MS分析的蛋白。

Q2：使用O Glycosidase 处理 糖蛋白后，没有看到糖链的去除，可能的原因？

A2：蛋白质的糖基化修饰有N-糖基化及O-糖基化修饰，O-Glycosidase 适用于释放 附着于Ser / Thr 的Core 1 和 Core 3 O-连接的二糖核心。如果底物中确定含有 O-糖链，请确保同时使用Neuraminidase，以释放末端的唾液酸修饰基团。同时 由于空间位阻效应（蛋白质的二级结构和三级结构）可以阻碍内切糖苷酶到达 其底物作用位点，在去糖基化之前进行变性有助于O-连聚糖有效的释放。如果 不想变性处理，则考虑添加更多的酶或延长孵育时间。

Q3：在天然条件下释 放糖蛋白的糖 链，需要使用多 少Rhinogen® O Glycosidase？

A3:当蛋白质不变性时，O-Glycosidase因为空间位阻效应可能难以到达糖链的酶切 位点（因为二级和三级蛋白质结构）。添加更多的酶量及延长反应时间可能有 助于糖链释放效率的提高，但对于不同的糖蛋白样品，去糖基化活性高度依赖 于反应条件，建议进行适当优化或根据经验确定最优的操作方法。

Q4:是否可以同时使 用PNGase F、O Glycosidase 及α 2-3,6,8,9 Neuraminidase?

A4:是的。Rhinogen® PNGase F 及 O-Glycosidase 采用相同的缓冲液及反应条件，而 α2-3,6,8,9 Neuraminidase 具有非常宽 pH 适用范围（pH4.5-8.5），在 PNGase F 及O-Glycosidase 反应体系中具有较好的活性，三者可以同时使用。