背景：

O-糖苷酶（O-Glycosidase，EC 3.2.1.97）是一类重要的糖基化研究的工具酶。Rhinogen^® O-Glycosidase是O-Glycosidase基因重组并表达于大肠杆菌BL21中的重组酶，能够将糖蛋白中Ser或Thr残基的羟基连接的Core 1（Gal-β(1-3)-GalNAc-）及Core 3（GlcNAc-β(1-3)-GalNAc-）O-连双糖释放下来，如图1。该酶对α-GalNAc结合是特异性的，但对于Ser或Thr残基没有明显的偏好，同时糖蛋白的变性与否也不显着影响O-去糖基化的效率。核心结构的任何修饰都可以阻断O-Glycosidase的作用，最常见的修饰是核心结构的单、二或三唾液酸化。除此以外，核心结构还可能被岩藻糖，N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺残基进一步取代修饰，核心结构以外的单糖必须通过一系列外切糖苷酶依次切割，直到仅保留Core 1或Core 3二糖核心。然后O-Glycosidase才能够完整的从Ser或Thr残基上释放二糖核心，如图2。通常O-Glycosidase的使用都需要配合唾液酸酶。

图1 Rhinogen^® O-Glycosidase作用O-连二糖核心的类型

图2  复杂O-聚糖结构的糖链释放

产品包装：

Rhinogen^® O-Glycosidase包装规格如下：

储存体系：

QPF-004储存在缓冲液中，以液体的形式提供。缓冲液的组成为：50 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 7.5。

配套试剂：

Rhinogen^® O-Glycosidase 配套提供的试剂如下：

产品来源：

Rhinogen^® O-Glycosidase是一种将O-Glycosidase基因重组并表达于大肠杆菌BL21中的重组酶，分子量大小约为147kDa。

产品质量：

SDS-PAGE分析，纯度≥95%；没有检测到污染的外切糖苷酶、糖苷内切酶及蛋白酶活性。 

产品特性：

最适反应pH为7.5；热失活条件：65°C处理10 min。 

酶活定义：

1个酶活力单位定义：在100 μl反应体系中，37°C，pH7.5条件下，1小时内从5mg唾液酸酶消化后的非变性fetuin 上催化释放0.68nmol O-连二糖所需要的酶量。

储存条件：

-20℃条件下，避免反复冻融。 

应   用：

1.O-聚糖结构分析；

2.糖蛋白生物合成分析；

3.涉及O-聚糖的病理生理学研究；

4.治疗性重组蛋白的表征及质量控制；

5.癌症研究和异常O-糖基化的鉴定及体外诊断。

Q1:使用 O-Glycosidase 处 理糖蛋白后，没有 看到糖链的去除， 可能的原因？

A1:蛋白质的糖基化修饰有N-糖基化及O-糖基化修饰，O-Glycosidase适用于释放附着 于Ser / Thr 的 Core 1和 Core 3 O-连接的二糖核心。如果底物中确定含有O-糖链， 请确保同时使用 Neuraminidase，以释放末端的唾液酸修饰基团。同时由于空间位 阻效应（蛋白质的二级结构和三级结构）可以阻碍内切糖苷酶到达其底物作用位 点，在去糖基化之前进行变性，同时按实验操作加入NP-40溶液有助于O-连聚糖 有效的释放。如果不想变性处理，则考虑添加更多的酶或延长孵育时间。

Q2：在天然条件下释 放糖蛋白的糖链， 需要使用多少 Rhinogen® O-Glycosidase？

A2：当蛋白质不变性时，O-Glycosidase 因为空间位阻效应可能难以到达糖链的切割位 点（因为二级和三级蛋白质结构）。添加更多的酶量及延长反应时间可能有助于 糖链释放效率的提高，但对于不同的糖蛋白样品，去糖基化活性高度依赖于反应 条件，建议进行适当优化或根据经验确定最优的操作方法。

Q3：如何抑制 O-Glycosidase 的 活性？

A3：SDS是O-Glycosidase酶活的有效抑制剂。

Q4：是否可以同时使 用PNGase F、 O-Glycosidase 及 α2-3,6,8,9 Neuraminidase?

A4:是的。Rhinogen® PNGase F 及 O-Glycosidase 采用相同的缓冲液及反应条件，而 α2-3,6,8,9 Neuraminidase 具有非常宽 pH适用范围（pH4.5-8.5），在 PNGase F及 O-Glycosidase 反应体系中具有较好的活性，三者可以同时使用。